引言

6月16日，Active Motif 在Communication  Biology上发表了题为《Anchor-based bisulfite sequencing determines genome-wide DNA methylation》的技术文章。

在本研究中，我们将ABBS作为一种在全基因组范围内进行5-mC定位的方法。

与其它靶向方法一样，ABBS提供单碱基分辨率的甲基化检测，并且不局限于预定的基因组片段。

虽然对低甲基化区域的覆盖率受到技术限制，但该方法保持了与WGBS相当的准确性，同时提高了甲基化区的敏感性，可用于大幅降低所需的测序量。

因此，ABBS或将成为一种在全基因组范围内对甲基胞嘧啶进行经济高效和单碱基分辨率检测的强有力的替代方法。

 

背景

胞嘧啶在其第五个碳上的甲基化所产生的5-甲基胞嘧啶（5-mC），是迄今为止哺乳动物中最丰富的表观遗传修饰。

自90多年前发现以来，它引起了人们极大的兴趣（Johnson&Coghill，JACS，1925）。

在哺乳动物中，通过DNA甲基转移酶（DNMT）介导，胞嘧啶DNA甲基化主要发生在CpG岛（CG或CpG）。

这种表观遗传标记对基因表达调控至关重要，当富含基因启动子时，胞嘧啶甲基化通常与基因沉默有关，然而，在基因体中发现的甲基化与转录活性增加有关（Yang等人，Cancer cell，2014）。

DNA甲基化也存在于增强子、重复序列和其他基因组元素中，其失调涉及许多疾病，例如癌症（Yang等人，cancer cell，2014）。

因此，了解5-mC的分布是许多科学家研究的课题之一，从而出现了大量的5-mC全基因组研究方法。

 

 5-mC的富集方法

常用的5-mC的富集方法依赖于捕捉甲基化后的DNA片段。

最经典的富集方法是甲基DNA免疫沉淀，然后进行测序（MeDIP-seq，Down等人，Nature Biotech，2008）。

MeDIP-seq使用特异识别单链DNA的5-甲基胞嘧啶的抗体捕捉甲基化DNA片段。

Methylated-CpG Island Recovery Assay测定（MIRA）是另一种广泛使用的5-mC定位方法，利用MBD2b-MBD3L1复合物对甲基化DNA的高亲和力（Rauch等人，Investig.J.Tech.Methods Pathol，2005）对甲基化区域进行富集。

每种方法都有其优缺点。

MeDIP-seq使用一种识别单个5-甲基胞嘧啶的抗体，并且大部分不受甲基化密度的影响。

相比之下，MBD2b-MBD3L1复合物的亲和力随甲基化密度而变化，允许低、中或高甲基化密度片段区域的特定富集。

然而，MIRA并没有评估全基因组范围每个CpG岛的甲基化（Jung等人，Epigenomics，2015）。

以上两种富集方法通常成本较低，但仅能确定一般甲基化的水平从而提供半定量的信息，而不能提供准确的甲基化百分比信息。

且5-mC检测的分辨率也有限，取决于捕获的DNA片段的大小（通常在100-300 nt之间）。

因此，当需要单碱基分辨率或需要精确的甲基化水平测定时，研究人员往往需要其它方法。

 

亚硫酸氢盐测序

亚硫酸氢盐测序能够实现单碱基分辨率的胞嘧啶甲基化的定量分析，但成本更高。

20世纪70年代，发现NaHSO₃对胞嘧啶具有诱变作用（Hayatsu等人，Biochem Biophys Res Commun，1970），但对5-甲基胞嘧啶没有诱变作用（Wang等人，NAR，1980）。

用NaHSO₃处理DNA导致未甲基化胞嘧啶脱氨基为尿苷，然后在sanger测序时将尿苷读取为胸腺嘧啶。

相比之下，5-甲基胞嘧啶对亚硫酸氢盐介导的脱氨作用不敏感，被解读为胞嘧啶（Frommer等人，PNAS，1992）。

随着NGS测序的出现，由亚硫酸氢盐测序衍生的高通量方法——命名为全基因组甲基化测序（WGBS）——由Joe Ecker和Salk研究所的同事开发，产生了第一个全基因组、单碱基分辨率的5-甲基胞嘧啶图谱（Lister等人，Nature，2009）。

这项突破性的研究为DNA甲基化领域的发展奠定了基础。

虽然WGBS是目前5-mC图谱的黄金标准，但其成本可能过高，因为要准确确定DNA甲基化水平，需要对整个基因组进行超过25倍的覆盖。

因此，可选的策略是只分析感兴趣的特定区域，以此来降低5-mC mapping的成本。

例如，简化基因组甲基化测序（RRBS）仅测量高CpG密度区域的DNA甲基化（Meissner等人，NAR，2005），而基于阵列的分析（例如Illumina Infinium®）获得一组预先选择的感兴趣区域（Moran等人，Epigenomics，2016）。

这些策略大大降低了5-mC的测序成本，但却只覆盖了基因组的一小部分。

 

基于锚定的亚硫酸氢盐测序（ABBS）

为了克服现有方法的局限性，锚定的亚硫酸氢盐测序（ABBS）作为一种新方法应运而生，用于在全基因组范围内检测DNA甲基化。

ABBS是由Active Motif开发的一项新技术，最近在《Communication Biology》上发表（Chapin等人，Commun Biol，2022）。

这里使用的策略通过提高对DNA甲基化区域的信息的获取能力，以降低成本，同时保持碱基分辨率。

为此，锚定引物被设计为在亚硫酸氢盐处理后特异性靶向5-mC位点，允许优先测量甲基化基因组区域（相对于5-mC缺失区域）中的甲基化水平。

当以MeDIP-seq、WGB和RRBS为基准时，发现基于锚定的方法具有很高的准确性（与WGB相当），并且它在甲基化区域中提供了更高的测序覆盖率（与MeDIP-seq相当）。

ABBS对甲基化胞嘧啶的检测也显示出更高的灵敏度，同时大大降低了相对于WGB的测序成本（超过10倍）。

 

展望

修饰胞嘧啶不只有DNA甲基化这一种表观遗传学标记。

TET甲基双加氧酶是重要的基因表达调节因子，可将5-mC氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）和进一步氧化（Tahiliani等人，Nature，2009；Ito等人，Science，2011）。

5-hmC存在于启动子、基因体和其他调节元件中，并参与基因表达的控制（Delatte等人，EMBO J，2014）。

5-hmC丰度约为5-mC水平的十分之一，这使得5-hmC的mapping更具有挑战性。

由于ABBS将测序能力集中在发生修饰的区域，因此5-hmC的低丰度不是一个障碍。

事实上，ABBS的最大优点是，随着测序覆盖率成比例增加，修饰越少，成本就越低。

随着越来越多的DNA修饰被发现，ABBS可能有意想不到的新应用，基于锚定的策略是否可以扩展到新的胞嘧啶修饰？这将是令人兴奋的探索过程。

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参考文献
[1] Johnson T B, Coghill R D. Researches on pyrimidines. c111. the discovery of 5-methyl-cytosine in tuberculinic acid, the nucleic acid of the tubercle bacillus1[J]. J.am.chem.soc, 1925, 47(11).
[2] Yang X, Han H, Decarvalho D, et al. Gene Body Methylation Can Alter Gene Expression and Is a Therapeutic Target in Cancer[J]. Cancer Cell, 2014.
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[4] Rauch T, Pfeifer G P. Methylated-CpG Island Recovery Assay: a New Technique for the Rapid Detection of Methylated-CpG Islands in Cancer[J]. Laboratory Investigation, 2005, 85(9):1172-1180.
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