自1983年James Broach在Genes&Dev 上首次公布了染色质免疫共沉淀（ChIP）技术以来，ChIP一跃成为广大研究者获得与蛋白互作DNA信息的主要技术，也成为了经典的实验技术。
2019年，来自美国弗雷德哈钦森癌症研究中心的 Henikoff 博士在Nature Communication上发布了关于CUT&Tag技术的文章，CUT&Tag技术正式面世。
从实验流程上看，CUT&Tag技术是一项能够更加高效便捷地获得DNA与蛋白互作信息的技术。 
同为研究DNA与蛋白质互作的实验技术，经典的ChIP技术和新兴的CUT&Tag技术有哪些异同呢？  

技术概述
ChIP（Chromatin Immunoprecipitation）技术的主要目的是研究目的蛋白（包括：修饰组蛋白，转录因子，辅因子及其他染色质蛋白）在染色质上的定位及丰度分析。
实验的基础步骤是使用甲~醛溶液将DNA和作用蛋白交联固定在一起后，提取染色质并将染色质剪切到一定的片段大小，再用染色质蛋白特异性抗体，通过免疫沉淀富集感兴趣的染色质片段。 
而新兴的CUT&tag技术（Cleavage Under Target and Tagmentation）基于ChIP（Chromatin immunoprecipitation）原理，同样是利用抗体识别并结合目标蛋白和修饰的组蛋白。
但与ChIP的免疫沉淀步骤相比，CUT&Tag经抗体孵育后便直接剪切染色质和制备文库。
CUT&Tag利用Tn5转座酶与protein A的融合蛋白，将酶引导至与染色质上目标结合的抗体。
Tn5转座酶预先加上adapter（生成组装的pA-Tn5转座体）以进行抗体靶向标记。 


总体差异对比

	ChIP-Seq	CUT&Tag
是否需要固定	需要	不需要
染色质片段化方法	超声或限制性内切酶	基于Tn5的片段化
所需细胞数量	20-100万	可应用于单细胞
所需测序深度*	20-50M reads	2M reads**
是否整合建库过程	否，需要另外的建库步骤	是，通过片段化加接头
适用的靶点	广泛适用于组蛋白修饰、转录因子和辅因子	主要适用于组蛋白修饰，少许转录因子和辅因子
所需时间	36-48小时	＜12小时

* Kaya-Okur et al. Nature Communications (2019) 10:1930
** 对于丰度较低的靶点，建议测序深度8-10M reads  


实验操作部分 
样本选取
ChIP实验可使用多样的样本类型，如组织，细胞，FFPE样本等，但ChIP实验的开展往往需要上百万的细胞或者大量的组织才能够满足需求。
对于如胚胎细胞，原代细胞等量少且珍贵的样本类型，ChIP实验往往很难顺利开展，这使得样本量成为了实现ChIP实验的一大阻碍。 
而对于CUT&Tag技术而言，细胞量的多少不再是实验顺利开展的阻碍。
在Henikoff 博士的文章中，我们看到CUT&Tag不仅仅能够从60个细胞中获得优良的数据，而且还能够与单细胞测序相结合，使得科研工作者能够从更少的细胞中获得更多的数据。 
但值得注意的是，在CUT&Tag的样本准备环节中，需要使用Concanavalin A或者说是ConA beads来富集细胞，这个beads可以通过结合细胞膜/细胞核上的glycoconjugates（糖复合物）从而实现细胞的富集。
但细胞膜和细胞核上的糖蛋白受体数量相差巨大，同样的样本用细胞和细胞核的富集效果可能存在差异。
且对于一些特殊处理的样本（如FFPE），CUT&Tag技术可能还需进一步优化改良。  

实验流程   
ChIP
  
图一 ChIP实验流程图 

经典的ChIP实验需要经过细胞（组织）固定，染色质制备，IP，解交联与DNA的纯化等多个步骤才能获得科研工作者们想要的结果。
在ChIP的每一步实验中都需要根据具体实验样本，实验条件进行优化。
如染色质的片段化过程，可使用超声法和酶切法。
采用不同方法获得的染色质片段会有不同的片段状态。 
在IP过程所用的抗体也需要是ChIP级别，因为经过固定够的细胞和组织，其表位与原生表位结构可能不一样。 

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CUT&Tag


图二 CUT&Tag实验流程图 

相比于ChIP实验的繁琐，CUT&Tag技术所用的细胞不需要固定，是自然状态的细胞。
而且在抗体的孵育过程中，所用的抗体也是有别于ChIP实验的，是需要CUT&Tag级别的抗体。 
CUT&Tag捕获的目标区域也不需要经过纯化步骤，因为Tn5的特性，经过转座酶处理后的细胞，染色质已经被片段化并且链接上了NGS测序所需要的adaptor，使得整个实验流程更加简便、高效。  

实验对照的设置
在传统的ChIP实验中，为了获得更加准确的实验结果，一般都会制备input样本和IgG阴性对照样本。
由于ChIP实验结果信号比较杂，背景噪声很大，所以常常需要input的数据来进行背景的处理。
在实验的同时设置IgG阴性对照，主要目的是验证ChIP实验理论上抗体的非特异性结合peak。 
相比较于ChIP，CUT&Tag由于采用Tn5酶的方法获得靶标蛋白互作的DNA信息，所以背景较低，并不需要input样本矫正背景。
阴性对照的设置也与ChIP不同，一般建议仅使用二抗而不使用一抗，这将显示二抗和pA-Tn5在你的样本中的背景。
在CUT&Tag实验中包括IgG对照的目的是确定pA-Tn5是否特异性的定位于抗体所在/富集的基因组区域。
与ChIP Seq中使用的input对照不同，此阴性对照不用于分析。
Active Motif R&D团队发现添加IgG对照不会增加任何有价值的信息，因为pA-Tn5已经被证明是特异的。  

数据分析部分

图三 ChIP和CUT&Tag数据比较 
我们采用K562细胞进行实验，使用了几种不同的抗体：H3K27me3(深蓝色)，phospho-Pol2Ser2(红色), CTCF(橙色), H3K4me3(绿色), H3K9ac(浅蓝色)，H3K9me3(紫色)，H3K27ac(黑色)来进行检测。
与ENCODE的数据进行比对，CUT&Tag-IT™ Assay Kit 仅仅使用10,000个细胞却能与ENCODE至少1,000,000细胞的数据有高度一致性。
CUT&Tag实验中所用到的抗体： H3K27me3（货号39155）, CTCF（货号61311）, H3K4me3（货号39159）, H3K9ac（货号39917）, H3K9me3（货号39161）, H3K27ac（货号39133）。

无论是ChIP还是CUT&Tag所获得的测序数据，均需要经过数据质控，比对到参考基因组，后续在进一步确定Peak等。
从整体的分析流程上，两者大同小异，但从数据质量上CUT&Tag相比于ChIP可能更胜一筹：

• CUT&Tag具有更低的背景噪声。
• CUT&Tag所需的测序深度更低。
• 数据的可重复性有所提高。

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总结
新技术的出现，必将对经典的技术产生冲击。
新技术用它的魅力吸引着无数科研工作者向她走去，但并不是所有的科研工作者都能从新技术中获得重大突破。
CUT&Tag作为前沿技术，其缺陷还未一一暴露，因此CUT&Tag优化必须小心进行，并且工作流中的每一步都应该通过适当质控检测。
也并不是所有的靶标都能用CUT&Tag获得优良的数据结果，如转录因子，由于CUT&Tag使用的是自然状态的细胞，许多转录因子并不大量表达，且与DNA的结合是微弱的、瞬时的，甚至有时还是通过间接的方式与染色质相结合。
对于这些情况，染色质交联和超声处理是检测蛋白质-DNA相互作用的必要步骤。
 用于CUT&Tag的Tn5转座酶对开放染色质区域具有高度亲和力。
因此，CUT&Tag可能优先适用于分析组蛋白修饰或与基因组活跃转录区域相关的转录因子，而不是非常适合于分析沉默或含有异染色质的基因组区域。
消化时间和pA-Tn5使用量需要针对每个目标仔细优化，以避免任何不特异的转座反应。 

总的来说，当需要获得与靶标蛋白相互作用的DNA信息的时候，科研工作者们还是需要根据具体的课题设计以及实验条件，选择合适的实验方法进行课题研究。
而无论是ChIP还是CUT&Tag，Active Motif都有成熟的完整试剂盒，帮助大家快速掌握这两门实验技术。
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