浅谈生信的分析过程！如何从原始数据到结果报告？

引言

大多数科研工作者都熟悉ChIP-Seq和ATAC-Seq的实验流程，甚至熟悉文库的准备和分析，但关于测序和分析数据之间的步骤，可能只有熟悉生物信息分析的科研工作者才清楚知晓。

我们大多数人都知道，原始数据通常是一种称为FASTQ的文件格式。

但我们如何在基因组浏览器上从FASTQ文件获取峰值呢？

我们Active Motif拥有多年的生信分析经验，下文由我们简单介绍一下这其中的有关内容吧！这些相关步骤也包含在我们的一站式表观遗传学服务内容中。
 

 测序——一切的开始

首先，Illumina测序器的Flow cell加载了多路复用文库，我们的ChIP-Seq实验的湿实验室部分已经完成。

测序仪创建一个BCL（二进制基本调用）文件，其中包含来自flow cell上所有多路复用文库的数据。

此时，每个文库都会被测序得到，但此时文库对应的reads被混合在一起的。

我们可以利用每个文库上的Barcode条形码，以便仅将属于每个样本的reads分离到各个库中。

使用Illumina软件bcl2fastq，可以执行解复用，为每个库生成名为FASTQ文件的单独数据文件。

第一步是完成Illumina样本表，这是一个CSV（逗号分隔）文件，您可以在Excel中编辑该文件，软件会识别该文件中的以下信息：

1）哪个库具有哪个条形码序列；

2）运行单端或双端；

3）运行了多少个周期（也称为reads长度）。

如果客户选择自己进行分析，我们也可以将FASTQ文件作为结果交付给客户。而对于选用了我们一站式服务的客户，我们还会为其做后续的分析。
 

 质量控制——评估您的结果

下一步是对测序结果的FASTQ文件进行质量评估。

使用名为fastqc的软件，我们可以评估碱基质量分布、adaptor污染、k-mer含量和duplication等指标。

此外，我们还使用Babraham Bioinformatics fastq_screen软件对这些库进行了多物种比较，以确认除样本来源物种外，没有其它物种的读数污染样本数据。

这些步骤是整个工作流程中的关键部分，可确保最终数据具有高质量并适合下游分析。

 

在QC之后，我们接下来将FASTQ文件中的原始数据与带注释的基因组进行比对并注释。

我们已经得到了可用的reads，但还不知道它们在基因组上对应的区域。

人类、小鼠、大鼠、斑马鱼、果蝇、酵母和蠕虫等的基因组都有足够的注释来比对FASTQ文件。

我们使用名为BWA（Burrows-Wheeler-Aligner）的软件将测序结果映射到带注释的基因组（Li和Durbin，2009）。

此过程从原始的FASTQ文件生成BAM文件。

BAM文件包含这些序列，同时还包含它们在基因组上对应的特定位置的坐标信息。
 

 获取片段峰

接下来，我们需要定义峰值（Peaks），为此，我们使用了MACS/MACS2（Zhang et al.，2008）或SICER（Zang et al.，2009）的软件套件。

这些程序使用BWA创建的BAM文件来确定整个基因组中每个样本中的reads是否富集以及在何处富集。

这些信号富集区域被称为“峰值（Peaks）”，并作为后续许多分析的功能单元。

需要注意的是，我们对数据进行了标准化处理，以便峰值“调用（Calling）”和后续观测不会受到技术变化的影响，而是更加依赖和反映了正在发挥作用的基础生物学。

这个过程会生成一个BED文件，其中包含染色体、bp起始位置、结束位置以及一系列与调用的每个峰值相关的元数据（meta data）。

 

此外，我们还生成了一个bigWig（.bw格式）文件，该文件包含相同的峰值信息，其大小为100-200 MB，比原始的FASTQ文件（可能在1-2 GB之间）更方便传输。

在生成这些bigWig 文件后，我们就可以将数据上传到基因组浏览器（如UCSC基因组浏览器）或基因组浏览器程序（如IGV）（Integrative Genomics Viewer；Robinson et al.，2001）。

研究人员只需要简单地把bigWig 文件拖放到IGV中，即可直观地查看感兴趣的区域的相关数据。

或者，他们也可以将托管在FTP服务器上的bigWig文件链接到UCSC基因组浏览器。

研究人员可以使用基因组浏览器搜索基因/位点，比较轨迹，并截图以供使用。

 

峰值调用（peak calling）完成后，现在是执行下游分析的时候了。

因为我们分析的是有参基因，所以我们可以在上面分析很多的特征，例如离这些peak最近的基因或该基因的启动子区域。

通常，我们的客户对差异分析感兴趣，即将一组样本与另一组样本进行比较，以确定信号显著不同的区域。

使用R软件包DESeq2，我们可以获得特定峰值样本之间的定量差异（Love等人，2014）。

由于这些峰值区域已被标注到附近的基因组特征中，因此研究人员可对这些差异区域进行深入探讨，是何因素导致了这样的差异，从而又实现了怎样的功能。
 

 在FASTQ之后

Active Motif完成全套生物信息学分析服务后，会交付给客户所有分析样本的FASTQ（原始的raw data）、BAM（对齐后的reads）和bigWig（峰值数据）文件。

除此之外，我们还提供一套包含图表、注释文件和基因组浏览器截屏等信息的分析报告，当用户认真解读所有这些数据结果，便可针对自己研究的表观遗传学问题得到进一步的结论或见解。

除了ChIP-Seq、ATAC-seq技术服务外，我们还提供表观遗传研究中常用的其它实验技术服务——包括RNA-Seq、DNA甲基化分析等，Active Motif有超过20年的相关技术服务经验：

  我们提供  

 

○ChIP-Seq服务

○CUT&Tag服务

○ATAC-Seq服务

○单细胞ATAC-Seq服务

○Mod Spec® 服务

○RIME

○RNA-Seq服务

○单细胞RNA-Seq服务

○ChIP抗体验证服务

○ChIP-qPCR服务

○DNA甲基化服务

○Hi-C服务

 

只需要准备好样本，

剩下的交给我们！

 

参考网址：

bcl2fastq和bcl2fastq2：

https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software.html

Fastqc：

https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/

fastq screen: 

https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/

UCSC Genome Browser: 

http://genome.ucsc.edu

 

参考文献：

[1] Heng, Li, Richard, et al. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform [J]. Bioinformatics, 2009.

[2] Yong, Zhang, Tao, et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) [J]. Genome Biology, 2008.

[3] Zang C, Schones D E, Zeng C, et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data[J]. Bioinformatics, 2009(15):1952-1958.

[4] Robinson J T. Integrative genomics viewer[J]. Nature Biotechnology, 2011, 29(1):24-26.

[5] Love M I, Huber W, Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2 [J]. Genome Biology, 2014, 15(12):550.