无论是通过 ChIP-qPCR 来检测 ChIP 实验是否成功，为后续的建库和测序做准备，还是通过 qPCR 的方式来检测蛋白与目标区域 DNA 的结合，正确的设计 ChIP-qPCR 引物可以节省大量的时间和精力。很多刚开始接触 ChIP 实验的同学和老师们常常对如何设计 ChIP-qPCR 引物感到有些迷茫，这里让 Active Motif 技术专家一步一步教你如何设计吧。

第一种情况：
如果你手里有相应的参考文献，那么你可以直接忽略下文，使用文献里 ChIP-qPCR 的引物序列，连引物验证别人都已经帮你做好了。

第二种情况：
如果不能从文献里找到所需要的信息，那我们可以通过已发表的数据来设计。
2016 年 Shirley Liu Lab 推出的 Cistrome Data Browser（http://cistrome.org/db/#/）收集了来自 GEO, ENCODE 和 Roadmap Epigenomics 中已发表的人和小鼠 ChIP-Seq 数据，进行整理和分析并对其数据质量按照一套完整的质控参数进行评价，虽然这个数据库可以用来做更重要的事，不过在设计引物的时候参考可信度更高的 ChIP-Seq 数据，何乐而不为呢？

首先，打开 Cistrome Data Browser，http://cistrome.org/db/#/

如图，选择关注的物种，特定细胞 / 组织，组蛋白修饰 /TF，并筛选通过所有质控指标的数据（但如果数据不多的时候就放弃这一条吧）。



单击选中一行数据，就可以在页尾看到这个数据的各种参数啦。

如图，这个 ChIP-Seq 的数据的各个质控参数都还可以，PBC>82%，表明建库过程中没有 PCR bias。用 Phastcon 检测 ChIP-Seq 数据中结合位点的保守性，因为 TF 的 DNA 结合序列在物种间相对保守，这种中间峰值最高，两边对称降低的保守性分析结果，表明数据质量更为可靠，但组蛋白修饰并不一定遵循这一规律。



可以同时选几个 ChIP-Seq 数据，在 UCSC 中查看



选择在三组数据中都有 peak 的区域，Zoom In。在有 peak 富集的区域选择 DNA 序列用来设计阳性对照的引物。对于你感兴趣的结合位点，可以先定位到基因，再根据 ChIP-Seq 的数据选择有 peak 富集的区域。





获取 DNA 序列







获得 DNA 序列了，就可以进一步利用 Primer 3 等软件进行 qPCR 引物的设计，用 Blast 检验引物特异性了。
对于阴性对照的引物，可按照同样的方法，选择没有 Peak 富集的区域进行设计。

对于研究人，大小鼠，果蝇，酿酒酵母和斑马鱼的小伙伴们。还有一个最简单的方法，那就是直接购买。Active Motif 提供一些现成的经过验证的 ChIP-qPCR Control Primer Sets（如下图）, 可以作为阴性对照引物或阳性对照引物直接使用，也省去各种检验的麻烦，更多产品信息可登陆官网查看或联系我们咨询。



第三种情况：

如果你缺乏相关的 ChIP-Seq 数据作为参考，仍然有一些小的技巧可以帮助你设计引物。

看看你买 ChIP 抗体的公司网页，是否有 ChIP 验证的数据，可以作为参考来设计阴性和阳性对照引物。根据已有的数据判断可能结合的位置，如组蛋白修饰 H3K4me3 通常在转录起始位点（TSS）附近，引物设计通常选 TSS 上游 500-1000bp 和 TSS 下游 500bp。对于其它蛋白，它是否有特定的 DNA 结合序列，如果是的话，检验有该序列的区域。对于 TF，以 TSS 附近的 DNA 序列设计引物是一个很好的着手点，此外，可以看一下启动子区域是否有其它顺式调控元件或已知的其它蛋白结合位点，你关注的蛋白有可能会和其它蛋白在该位点上形成蛋白复合体。

最后，多设计几个位点的引物，多试一下吧。

第四种情况：
如果你研究的是一个非常新的蛋白，完全没有任何可参考信息，那么做 ChIP 的时候加一个阳性对照的抗体来帮助检验 ChIP 的实验操作，然后直接建库测序分析数据吧。根据得到的数据再选择感兴趣的位置进一步做 qPCR 验证。

引物设计 Tips:
1. TF 结合的区域通常是启动子，UTR 这些 A/T 比例比较高的区域，因而如果设计出来的引物 Tm 值略低，也是正常的，只要可以保证引物的特异性，不必强求退火温度比 Tm 低 5 度。
2. qPCR 的产物长度一般不要太长，80-150bp 就可以，因为在 ChIP 实验中染色质被片段化，你的 PCR 扩增的片段越长，这段 DNA 被打断的可能性就越大，丢失的信息也就越多。
3. 在使用珍贵的 ChIP 样品前，先用 genomic DNA 做个 qPCR 来检验引物的效率和特异性吧。

什么？你觉得上面的方法还是太麻烦了？帮人帮到底，还有最后一个办法，直接提供样本给 Active Motif 吧，我们将为您完成所有的实验和数据分析，你需要做的就是准备样本和躺等数据。



联系我们：021-20926090
                Techchina@activemotif.com

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