Active Motif ChIP 实验技术 : ChIP-Seq 样本间如何做定量比较？

引言
Active Motif 与Constellation制药合作开发了一种新的用于ChIP-Seq的标准化数据校正技术。将这种技术应用于检测药物处理前后组蛋白修饰的变化，成功地检测出人源细胞全基因组水平上H3K27me3的变化。这种全新的方法可以帮助研究者对经过不同处理的样本的ChIP-Seq数据做比较，揭示用传统方法无法检测到的变化。

文章2016年11月22日发表于PLOS one杂志。



原文链接：http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0166438

>>> 标准ChIP-Seq方法检测不到EZH2抑制剂处理前后H3K27me3水平的变化

EZH2是组蛋白H3K27特异性的甲基转移酶，在转录抑制上发挥着重要的作用。基因组学和转录组学数据都将EZH2识别为很多人类恶性肿瘤的候选靶点。如前列腺癌，乳腺癌以及血液恶性肿瘤。在扩散的B细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤以及黑色素瘤中也发现了复发的体细胞EZH2突变。

目前，许多EZH2的小分子抑制剂被应用于临床研究，被认为是很有潜力的肿瘤治疗药物。为了更好的了解EZH2的抑制作用对肿瘤细胞的影响，检测抑制剂引起的全基因组范围H3K27me3变化是非常重要的。

然而，使用传统的ChIP-Seq 步骤和分析方法来检测全基因组H3k27me3水平的变化被证实是非常困难的。

研究人员使用B细胞淋巴瘤细胞KARPAS-422和肺癌细胞PC9，分别用不同的EZH2抑制剂CPI360和GSK126处理之后用不同方法检测总体H3K27me3的变化。

WesternBlot检测结果显示两种细胞在加入抑制剂之后H3K27me3水平出现了显著的降低。

然而，当使用ChIP-Seq方法来想进一步检测加入抑制剂后H3K27me3在全基因组范围的分布变化的时候，却发现加入抑制剂样本组和加入DMSO样本之间没有差别。

>>> 为什么ChIP-Seq检测不到变化？
根据之前的报道，抑制剂处理之后，一些特异性位点的修饰水平发生了变化。通过qPCR的方式对该位点进行检测，两种抑制剂处理之后都检测到了H3K27me3的降低。

然而对建库之后的样本进行qPCR检测却检测不到变化。这说明ChIP-Seq检测不到变化很有可能是建库过程引起。

文库构建需要PCR扩增，导致不同样本之间的真实差异发生变化。抑制剂处理的样本免疫沉淀下来的DNA量是少于未处理样本的，但是建库之后，两组样本的DNA量是相同的。

>>> Active Motif Spike-in技术

一个看起来很直接的解决问题的方法是减少建库过程中的PCR循环数。

然而事实上，即使建库之后的DNA保留了建库之前沉淀下来的DNA量的差别，这种差别也会在cluster generation时丢失。

为了保证同一泳道不同样本之间数据量相同，每个样本的上样量是一样的。

为了解决这一问题，Active Motif 开发了果蝇染色质Spike-In技术，通过加入对照“保留”样本之间的差别。

标准的ChIP反应是使用样本染色质和抗体建立的。在“Spike-in”校正体系中，黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）染色质在免疫反应之前加入到样本染色质中混合。

免疫沉淀时不仅加入目标蛋白特异性抗体，同时也加入特异性的果蝇组蛋白变体H2Av抗体，这样目标蛋白抗体沉淀目标蛋白结合的DNA，果蝇组蛋白变体H2Av抗体沉淀出部分果蝇染色质。

沉淀出的所有DNA用于建库和测序。

测序之后，序列标签被分别比对到样本（如：人，小鼠等）基因组和果蝇基因组。因为不同样本之间加入的起始果蝇染色质是一样多的，理论上沉淀下来的DNA量也应该是一样的，这样不同样本之间的果蝇序列标签数就可以作为标准，用于校正样本之间的标签序列数。

使用这一方法成功检测到了EZH2抑制剂处理后全基因组H3K27me3水平的变化。

 

 Spike-in 技术已经应用于Active Motif 提供的ChIP-Seq技术服务。基于广大用户的需求，近期Active motif 也推出了Spike-in 产品。

>> 往期ChIP实验相关内容：
【Active Motif 实验技术】ChIP 实验染色质超声破碎指南（上篇）
【Active Motif 实验技术】: ChIP 实验染色质超声破碎指南（下篇）
【Active Motif 实验技术】如何判断ChIP是否成功？
【Active Motif 实验技术】如何才能做好 ChIP 实验？
 

作者招募 Active Motif 欢迎表观遗传领域小伙伴们前来投稿，分享伙伴们的研究进展、学术见解、实验方法、实验趣事、研究路上经历故事... ...    ◆ 投稿请联系：wzhao@activemotif.com      ◆ 微信可添加_表观小秘书：18521362870       期待您的加入~~

 

扫一扫下方微信二维码

关注Active Motif ChIP 技术交流群