- 移动端
上海艾跃（Active Motif）生物科技有限公司品牌商
10 年
手机商铺
- NaN
- 0.3999999999999999
- 0.3999999999999999
- 2.4
- 2.4
上海艾跃（Active Motif）生物科技有限公司
入驻年限：10 年
- 联系人：
Active Motif
- 所在地区：
上海 闵行区
- 业务范围：
试剂、实验室仪器 / 设备、技术服务、抗体
- 经营模式：
生产厂商 经销商
推荐产品
技术资料/正文
扒一扒！CUT&Tag 的前世今生
3882 人阅读发布时间：2021-03-24 16:13
在表观遗传学领域，染色质免疫沉淀（ChIP）是分析转录因子和辅因子与 DNA 结合，以及组蛋白和组蛋白修饰在整个基因组中定位的金标准技术。
染色质免疫沉淀实验涉及一个多步骤的过程，其中每一步对于获得可解释且可重复的结果都是至关重要的。此外，ChIP 通常需要相对较高数量的起始材料，这对于某些样品类型来说很难获得。尽管由于近年来高通量测序技术的发展，使得 ChIP-Seq 的分析变得更加有效，但是染色质免疫沉淀实验本身的核心原理自 30 多年前首次开发以来并没有显著的发展。
虽然 ChIP 仍然是研究蛋白质-染色质相互作用的主要方法，但是更新的、更简单、更高效的替代方案已经开发，并且克服了 ChIP 的一些局限性。今天介绍的就是 CUT&Tag 技术。
CUT&Tag 显示了很多前景，有可能克服一些 ChIP 实验的限制，但它也有自己的限制，必须加以考虑。本文介绍了什么是 CUT&Tag，以及它的前世今生。
CUT&Tag 是用于研究蛋白质与 DNA 之间相互作用，并为其感兴趣的蛋白质确定 DNA 结合位点的一种分子生物学方法。尽管 CUT&Tag 与 ChIP 方法在某些方面类似，但 CUT&Tag 实验的起始材料是活的可渗透细胞或分离的细胞核，而不是 ChIP 中使用的甲醛交联的细胞或组织。
在 CUT&Tag 实验中，细胞首先被通透化，并与固定在伴刀豆凝集素 A（ConA）涂层磁珠上的抗体一起孵育。该磁珠抗体可便于后续的清洗步骤。接下来，细胞与目标蛋白特异性抗体孵育，然后与二抗孵育。之后，细胞与组装的 Tn5 转座酶-蛋白 A 复合物孵育。该复合物带有 NGS 接头。Tn5 是一种镁离子依赖酶。在加入镁离子激活反应后，使靶蛋白附近的染色质被切割并插入 NGS 测序的 DNA 接头序列。孵育后，未反应的转座复合物被洗涤干净。这使得整个实验中的染色质可做到一步裂解和文库制备。
CUT&Tag 是非常敏感高效的，据报道，它能用 60 个细胞对组蛋白的一些修饰进行研究。在 ChIP 中，超声波随机打断的染色质，经过抗体免疫沉淀下来的 DNA，通常长度为几百至几千 bp。然而，在 CUT&Tag 中，转座子只在接近蛋白质结合位点的附近切割染色质，从而使 DNA 序列长度缩短。因此即使较低的测序深度（3-5M）也能得到高质量的数据，并且其背景信号比大多数 ChIP-Seq 的背景信号低。
最后，由于 CUT&Tag 使用完整的活细胞作为起始材料，而不是超声染色质，因此它可以适用于单细胞实验（scCUT&Tag）。
CUT&Tag 和类似方法的发展历程
为了从较少的起始材料中获得更高质量的结果，许多新开发的实验方法试图改善交联法 ChIP 的瓶颈。一些有意思的方法被开发出来，例如染色质内源性裂解法（ChEC）和 DamID。它们是基于核酸酶或 DNA 修饰酶与 DNA 结合蛋白的栓绑，使核酸酶或修饰酶可以在结合位点的局部附近消化或修饰 DNA。DamID 法和 ChEC 法分别利用 DNA 腺嘌呤甲基转移酶和微球菌核酸酶。在这两种方法中，DNA 都是直接从活细胞或通透性细胞中提取的，避免了染色质溶解和恢复过程中可能遇到的挑战。然而，这些方法需要在进行实验之前克隆和表达嵌合融合蛋白，使得工具酶栓绑在相关的蛋白质转录因子上，限制了这些技术在体内模型、患者样本和组蛋白翻译后修饰的应用。
CUT&Tag vs. CUT&RUN vs. ChIP-Seq
| CUT&Tag | CUT&RUN | ChIP-Seq | |
|---|---|---|---|
|
是否需要固定 |
不需要 | 不需要 | 需要 |
|
染色质片段化方法 |
基于 Tn5 的打断 |
MNase 消化 |
超声打断 |
|
所需细胞数量 |
0.5-50 万 | 50 万 |
100-1000 万 |
|
所需测序深度* |
2M reads | 8M reads |
20-50M reads |
|
是否整合建库过程 |
是，通过片段化加接头 |
否，需要另外的建库步骤 |
否，需要另外的建库步骤 |
|
适用的靶点 |
主要适用于组蛋白修饰，少许转录因子和辅因子 |
广泛适用于组蛋白修饰、转录因子和辅因子 |
广泛适用于组蛋白修饰、转录因子和辅因子 |
| 所需时间 | 1-2 天 | 1- 2 天 | 2-3 天 |
* Kaya-Okur et al. Nature Communications (2019) 10:1930
在 CUT&Tag 技术之前
受 DamID 和 ChEC 的启发，Skene 和 Henikoff 于 2016 年开发了 CUT&RUN 技术。CUT&RUN 是 Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease（靶区裂解和核酸酶释放）的缩写。与 ChEC 方法类似，CUT&RUN 利用了 MNase 的内切酶和外切酶活性。
在 CUT&RUN 中，MNase 与蛋白 A 融合（pA-MNase），以引导核酸酶在基因组区域的相关蛋白靶点结合的抗体附近的染色质进行切割。CUT&RUN 从活细胞中分离出来的细胞核开始，这些细胞核被固定在涂有凝集素的磁珠上。然后将细胞核与针对所需蛋白质的抗体和 pA-MNase 一起孵育。酶促反应通过添加钙离子开始。蛋白质-DNA 复合物可以分离纯化，直接用于文库的制备。
TAM-ChIP™
2011 年，Active Motif 开发了一种称为 TAM-ChIP 的新方法，用于分析蛋白质与 DNA 的相互作用。就像 ChIP 一样，TAM-ChIP 是在交联和超声处理的染色质上进行的。然而，TAM-ChIP 方案涉及使用与 Tn5 转座酶和 NGS 测序接头偶联的二级抗体。在琼脂糖珠捕获染色质后，镁离子激活 Tn5 的活性，在蛋白质结合位点的两侧进行切割，并加入测序文库接头，提供了更高分辨率的蛋白质结合位点鉴定。其他类似的方法，如 CUT&Tag，是对 Active Motif 的专利 TAM-ChIP 技术的改进。
CUT&Tag 技术的兴起
2019 年，Henikoff 的实验室将他们的 CUT&RUN 方法改进为 CUT&Tag。
CUT&RUN 方法很好，可以从 100-1000 个活细胞中产生高质量的测序数据。然而，这种方法仍然需要在制备文库之前进行额外的 NGS 接头连接步骤，因此很难适应单细胞应用。
CUT&Tag 使用 Tn5 转座酶，就像 TAM-ChIP 一样，在切割染色质的同时插入 NGS 接头来进行文库准备。这消除了操作过程中的耗时步骤，也有助于 CUT&Tag 从少量起始材料开始。
简而言之，CUT&Tag 可以像 CUT&RUN 那样对自然状态的染色质进行研究，并使用像 TAM-ChIP 一样的抗体引导标记技术。
下一步是什么？单细胞 CUT&Tag！
在最初的 CUT&Tag 文章中，来自 Henikoff 实验室的研究小组将 CUT&Tag 应用于单细胞分析。与 CUT&RUN 相反，CUT&Tag 适用于单细胞，因为从抗体结合到文库制备的整个反应都发生在完整的细胞或细胞核内。为了适应单细胞分析，对基本的 CUT&Tag 方案稍作调整。不用磁珠固定细胞，而是在洗涤之间离心细胞。在标记步骤之后，细胞作为单个细胞分布在纳米孔中，在测序之前进行编码。
CUT&Tag 是研究蛋白质与 DNA 相互作用的一种较新的分子生物学方法，与 ChIP-Seq 和 CUT&RUN 相比具有一些优势。
1、起始量低
在最早的 CUT&Tag 文献中，研究人员用了 60 个细胞来分析整个基因组中的 H3K27me3 基因谱。之所以 CUT&Tag 能用如此低的细胞数，是因为 pA-Tn5 可以直接在抗体结合位点切割 DNA，不需要染色质制备和可能导致样品丢失的超声处理步骤。对于研究特定细胞类型的研究人员来说，处理少量细胞的能力是一个优势，例如罕见的神经细胞群、胰岛或干细胞，这些细胞很难获得大量的细胞。
2、不需要固定或超声打断
CUT&Tag 是在未固定细胞或细胞核上进行的，避免了标准 ChIP 工作流程中的固定、染色质制备和超声处理步骤。超声波处理的设置非常具有挑战性，需要昂贵的专用设备。此外，过度固定和过度超声会破坏蛋白质表位，阻止它们被免疫沉淀。有些抗体在自然条件下效果更好。
3、速度很快
相对于 ChIP 的多步骤的过程，CUT&Tag 要快得多。细胞被固定在磁珠上，整个过程在一根管子里进行。标记步骤包括染色质剪切和同时插入测序文库接头，这适合于高通量实验。
4、测序量少
使用 CUT&Tag，在实验最后一步提取的染色质位于感兴趣蛋白质结合位点的附近。CUT&Tag 分离出的较短的 DNA 序列意味着它没有 ChIP-Seq 那样的深度测序要求。对于 CUT&Tag，3-5M reads 足以生成可靠的数据，这比 ChIP-Seq 分析（通常每个样本需要 30-50M reads）的测序量少了大约 10 倍。
CUT&Tag 的局限性
尽管 CUT&Tag 很有前景，但它确实存在一些局限性，可能会阻止它完全取代 ChIP-Seq 分析。
1、CUT&Tag 的非交联方案并不总是合适的
非交联细胞不适合每项实验。在最初的 CUT&Tag 文献中，只测试了组蛋白修饰、NPAT 和 CTCF。许多转录因子表达不丰富，弱或短暂地与 DNA 结合，或间接地与染色质结合。在这些情况下，染色质交联和超声是检测蛋白质-DNA 相互作用的必要步骤。
此外，大多数经 ChIP 验证的抗体可在交联条件下工作，并且可能无法在非交联条件下工作，因为交联条件下的蛋白质表位的可识别性可能不同于天然条件。因此，从 ChIP 转换到 CUT&Tag 需要彻底的抗体验证，以确定抗体在不固定条件下的特异性和敏感性。
2、CUT&Tag 仍然是新技术
虽然 CUT&Tag 似乎已经流传了很久，而且很快就流行起来了，但它只是在 2019 年 4 月才首次发表。因此，在同行评议的期刊上还没有一个很长的包含 CUT&Tag 结果的论文列表。尽管来自 Henikoff 实验室的文献相当完整，包含了大量比较 CUT&Tag 与 ChIP-Seq 和 CUT&RUN 的数据，但因为实验流程与 ChIP-Seq 非常不同， CUT&Tag 的实验数据可能很难与以前的 ChIP-Seq 数据进行比较，包括 ENCODE 项目的结果。
3、CUT&Tag 可能会引入偏差
用于 CUT&Tag 的 Tn5 转座酶对染色质开放区有很高的亲和力。因此，CUT&Tag 方法可能更适合于分析组蛋白修饰或与基因组活跃转录区域相关的转录因子，而不太适合分析沉默或含有异染色质的基因组区域。消化时间和 pA-Tn5 的使用量需要针对每个目标物进行仔细优化，以避免任何不特异的标记。
CUT&Tag 是一种很有前途的技术，如果这种方法像 ChIP-Seq 那样被广泛采用，时间会告诉我们答案。像每一个新的方法一样，所有的缺陷都还没有被检测出来，所以 CUT&Tag 的优化必须小心地进行，并且工作流程中的每一步都应该进行适当的质控。
总结：新方法正在打破表观遗传学研究的界限
与 ChIP-Seq 和 CUT&RUN 类似，CUT&Tag 允许在全基因组范围内鉴定蛋白质与 DNA 的相互作用。CUT&Tag 是一种敏感的方法，它利用二级抗体作为 Tn5 转座酶与蛋白 A 融合复合物的锚定物，在靶蛋白结合位点附近引导染色质 DNA 的切割，同时插入 NGS 测序接头。低背景信号使得这项技术适合使用少量细胞作为起始材料，如组蛋白修饰位点。此外，成本效益及其对单细胞技术的适应性也可能使这种方法成为高通量分析的一种选择。
Active Motif 的专利试剂盒 TAM-ChIP 所开创的抗体引导标记技术已经引导了 CUT&RUN 和 CUT&Tag 等实验方法的发展。这种技术在未来可能会适配越来越多的 NGS 测序方案。这些新方法开始打破界限，让研究人员把表观遗传学实验带到一个全新的水平，并将有助于在该领域进行新的探索和令人兴奋的发现。
本文原文作者：Anne-Sophie Ay-Berthomieu, Ph.D.
Active Motif 提供 CUT & Tag 完整解决方案：
-CUT & Tag 级的抗体
-CUT & Tag 试剂盒
-CUT & Tag 一站式技术服务
产品及服务详情可进入 Active Motif 丁香通商铺进行了解：https://activemotif.biomart.cn/